TIANSeq खंड/दुरुस्ती/टेलिंग मॉड्यूल

सध्या, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तंत्रज्ञान प्रामुख्याने पुढील पिढीच्या अनुक्रम तंत्रज्ञानावर आधारित आहे. पुढच्या पिढीच्या अनुक्रम तंत्रज्ञानाची वाचन लांबी मर्यादित असल्याने, आपण पूर्ण लांबीचा क्रम लहान तुकड्यांच्या लायब्ररीमध्ये क्रमाने मोडला पाहिजे. वेगवेगळ्या सिक्वन्सिंग प्रयोगांच्या गरजेनुसार, आम्ही सहसा सिंगल-एंडेड सिक्वन्सिंग किंवा डबल-एन्ड सिक्वन्सिंग निवडतो. सध्या पुढच्या पिढीच्या अनुक्रम ग्रंथालयाचे डीएनए तुकडे साधारणपणे 200-800 बीपीच्या श्रेणीमध्ये वितरीत केले जातात.

अ) डीएनए गुणवत्ता कमी आहे आणि त्यात अवरोधक असतात. सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य क्रियाकलाप प्रतिबंध टाळण्यासाठी उच्च दर्जाचे डीएनए नमुने वापरा.

ब) डीएनए लायब्ररी बांधण्यासाठी पीसीआर-मुक्त पद्धतीचा वापर करताना डीएनए नमुन्याचे प्रमाण अपुरे आहे. जेव्हा खंडित डीएनएचे इनपुट 50 एनजीपेक्षा जास्त असते, तेव्हा ग्रंथालय बांधकाम प्रक्रियेदरम्यान पीसीआर-मुक्त वर्कफ्लो निवडकपणे करता येते. जर लायब्ररीची कॉपी संख्या थेट अनुक्रम करण्यासाठी खूप कमी असेल तर, डीएनए लायब्ररी अॅडॉप्टर लिगेशन नंतर पीसीआर द्वारे वाढविली जाऊ शकते.

सी) आरएनए दूषिततेमुळे अशुद्ध आरंभिक डीएनए प्रमाणन होते जीनोमिक डीएनएच्या शुद्धीकरण प्रक्रियेत आरएनए दूषितता अस्तित्वात असू शकते, ज्यामुळे ग्रंथालयाच्या बांधकामादरम्यान चुकीचे डीएनए प्रमाण आणि अपुरे डीएनए लोडिंग होऊ शकते. RNase सह उपचार करून RNA काढला जाऊ शकतो.

ए -1

a) लहान तुकडे (60 bp-120 bp) दिसतात लहान तुकडे सामान्यत: अडॅप्टरचे तुकडे असतात किंवा अडॅप्टर्सद्वारे तयार केलेले डायमर असतात. Agencourt AMPure XP चुंबकीय मणी सह शुध्दीकरण हे अडॅप्टरचे तुकडे प्रभावीपणे काढू शकतात आणि अनुक्रम गुणवत्ता सुनिश्चित करू शकतात.

b) पीसीआर प्रवर्धनानंतर लायब्ररीमध्ये मोठे तुकडे दिसतात अॅडॉप्टर लिगेट झाल्यानंतर ग्रंथालयाच्या डीएनए तुकड्याचा आकार 120 bp ने वाढेल. जर अॅडॉप्टर लिगेशन नंतर डीएनएचा तुकडा 120 बीपी पेक्षा जास्त वाढला, तर ते जास्त पीसीआर प्रवर्धन च्या असामान्य तुकडा प्रवर्धनमुळे होऊ शकते. पीसीआर सायकलची संख्या कमी केल्यास परिस्थिती टाळता येते.

c) अॅडॉप्टर लिगेशन नंतर लायब्ररी डीएनए तुकड्यांचा असामान्य आकार या किटमधील अडॅप्टरची लांबी 60 बीपी आहे. जेव्हा तुकड्याची दोन टोके अडॅप्टर्सशी जोडली जातात, तेव्हा लांबी केवळ 120 बीपीने वाढेल. या किटद्वारे प्रदान केलेल्या व्यतिरिक्त अॅडॉप्टर वापरताना, कृपया अॅडॉप्टर लांबी सारखी संबंधित माहिती देण्यासाठी पुरवठादाराशी संपर्क साधा. कृपया खात्री करा की प्रयोग कार्यप्रवाह आणि ऑपरेशन मॅन्युअलमध्ये वर्णन केलेल्या चरणांचे अनुसरण करते.

d) अडॅप्टर लिगेशनच्या आधी असामान्य डीएनए फ्रॅगमेंट आकार डीएनए फ्रॅगमेंटेशन दरम्यान चुकीच्या प्रतिक्रिया परिस्थितीमुळे या समस्येचे कारण असू शकते. वेगवेगळ्या डीएनए इनपुटसाठी वेगवेगळ्या प्रतिक्रिया वेळा वापरल्या पाहिजेत. जर डीएनए इनपुट 10 एनजी पेक्षा जास्त असेल तर, आम्ही ऑप्टिमायझेशनची प्रारंभिक वेळ म्हणून 12 मिनिटांची प्रतिक्रिया वेळ निवडण्याची शिफारस करतो आणि यावेळी तयार केलेला तुकडा आकार प्रामुख्याने 300-500 बीपीच्या श्रेणीत असतो. आवश्यक आकारासह डीएनए तुकड्यांना अनुकूल करण्यासाठी वापरकर्ते त्यांच्या स्वतःच्या गरजेनुसार 2-4 मिनिटांसाठी डीएनए तुकड्यांची लांबी वाढवू किंवा कमी करू शकतात.

A-2

अ) फ्रॅगमेंटेशन टाइम ऑप्टिमाइझ केलेला नाही जर फ्रॅग्मेंटेशन डीएनए खूप लहान किंवा खूप मोठा असेल तर, प्रतिक्रिया वेळ निश्चित करण्यासाठी निर्देशात प्रदान केलेल्या फ्रॅगमेंटेशन टाइम सिलेक्शनसाठी मार्गदर्शक तत्त्वांचा संदर्भ घ्या आणि या टाइम पॉईंटला कंट्रोल म्हणून वापरा, याव्यतिरिक्त सेट अप करा विखंडन वेळेवर अधिक अचूक समायोजन करण्यासाठी 3 मिनिटे लांब किंवा कमी करण्यासाठी प्रतिक्रिया प्रणाली.

ए -3

विखंडन उपचारानंतर डीएनएचे असामान्य आकार वितरण

अ) फ्रॅगमेंटेशन रिएजंटची चुकीची पिघलनाची पद्धत, किंवा पिघळल्यानंतर अभिकर्मक पूर्णपणे मिसळलेले नाही. 5 × फ्रॅगमेंटेशन एंजाइम मिक्स अभिकर्मक बर्फावर वितळवा. एकदा वितळल्यानंतर, ट्यूबच्या तळाला हलक्या हाताने फ्लिक करून अभिकर्मक समान रीतीने मिसळा. अभिकर्मकाला भोवळ देऊ नका!

ब) डीएनए इनपुट नमुन्यामध्ये ईडीटीए किंवा इतर प्रदूषक असतात जे डीएनए शुध्दीकरण चरणात मीठ आयन आणि चेलेटिंग एजंट्सचे कमी होणे प्रयोगाच्या यशासाठी विशेषतः महत्वाचे आहे. जर डीएनए 1 × TE मध्ये विरघळला असेल, तर विखंडन करण्यासाठी सूचना मध्ये दिलेल्या पद्धतीचा वापर करा. जर द्रावणामध्ये ईडीटीएची एकाग्रता अनिश्चित असेल, तर डीएनए शुद्ध करण्याची आणि त्यानंतरच्या प्रतिक्रियेसाठी डीओनाइज्ड पाण्यात विरघळण्याची शिफारस केली जाते.

क) चुकीचे आरंभिक डीएनए प्रमाणन खंडित डीएनएचा आकार डीएनए इनपुटच्या प्रमाणाशी जवळून संबंधित आहे. विखंडन उपचार करण्यापूर्वी, प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये डीएनएचे अचूक प्रमाण निश्चित करण्यासाठी क्यूबिट, पिकोग्रीन आणि इतर पद्धतींचा वापर करून डीएनएचे अचूक प्रमाण आवश्यक आहे.

 d) प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी सूचनांचे पालन करत नाही खंडित प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी सूचनांनुसार काटेकोरपणे बर्फावर चालणे आवश्यक आहे. सर्वोत्तम परिणाम सुनिश्चित करण्यासाठी, सर्व प्रतिक्रिया घटक बर्फावर ठेवले पाहिजेत आणि संपूर्ण शीतकरणानंतर प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी केली पाहिजे. तयारी पूर्ण झाल्यानंतर, कृपया मिक्स करण्यासाठी फ्लिक किंवा पायपेट करा. भोवरा करू नका!

1. अयोग्य मिक्सिंग पद्धत (भोवरा, हिंसक दोलन इ.) लायब्ररीच्या तुकड्यांचे असामान्य वितरण (खालील आकृतीमध्ये दाखवल्याप्रमाणे) कारणीभूत ठरेल, त्यामुळे ग्रंथालयाच्या गुणवत्तेवर परिणाम होईल. म्हणून, फ्रॅग्मेंटेशन मिक्स रिअॅक्शन सोल्यूशन तयार करताना, कृपया मिक्स करण्यासाठी हळूवारपणे वर आणि खाली पिपेट करा, किंवा बोटांच्या टोकाचा वापर करून फ्लिक करा आणि मिक्स करा. भोवरा मध्ये मिसळू नये याची काळजी घ्या.

2. ग्रंथालयाच्या बांधकामासाठी उच्च शुद्धतेचा डीएनए वापरणे आवश्यक आहे

DNA चांगली डीएनए अखंडता: इलेक्ट्रोफोरेसीस बँड शेपटीशिवाय 30 केबी पेक्षा जास्त आहे

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. डीएनए इनपुट रक्कम अचूक असणे आवश्यक आहे नॅनोड्रॉपऐवजी डीएनए प्रमाणित करण्यासाठी क्यूबिट आणि पिकोग्रीन पद्धती वापरणे सुचवले आहे.

4. डीएनए सोल्यूशनमधील ईडीटीएची सामग्री निश्चित करणे आवश्यक आहे ईडीटीएचा विखंडन प्रतिक्रियेवर मोठा प्रभाव आहे. जर ईडीटीएची सामग्री जास्त असेल तर डीएनए शुद्धीकरण नंतरच्या चाचणीपूर्वी करणे आवश्यक आहे.

5. फ्रॅग्मेंटेशन रिअॅक्शन सोल्यूशन बर्फावर तयार करणे आवश्यक आहे फ्रॅगमेंटेशन प्रक्रिया प्रतिक्रिया तापमान आणि वेळ (विशेषतः वर्धक जोडल्यानंतर) साठी संवेदनशील असते. प्रतिक्रिया वेळेची अचूकता सुनिश्चित करण्यासाठी, कृपया बर्फावर प्रतिक्रिया प्रणाली तयार करा.

6. विखंडन प्रतिक्रिया वेळ अचूक असणे आवश्यक आहे विखंडन पायरीची प्रतिक्रिया वेळ थेट तुकड्यांच्या उत्पादनांच्या आकारावर परिणाम करेल, त्यामुळे ग्रंथालयातील डीएनए तुकड्यांच्या आकाराच्या वितरणावर परिणाम होईल.

1. या किटवर कोणत्या प्रकारचे नमुना लागू आहे?

या किटचा लागू नमुना प्रकार एकूण आरएनए किंवा चांगल्या आरएनए अखंडतेसह शुद्ध एमआरएनए असू शकतो. लायब्ररी बांधण्यासाठी एकूण आरएनए वापरल्यास, आरआरएनए प्रथम काढण्यासाठी आरआरएनए डिप्लेशन किट (कॅट#4992363/4992364/4992391) वापरण्याची शिफारस केली जाते.

2. या किटसह ग्रंथालय बांधण्यासाठी FFPE नमुने वापरता येतील का?

FFPE नमुन्यांमधील mRNA सापेक्ष खराब अखंडतेसह, एका विशिष्ट मर्यादेपर्यंत निकृष्ट होईल. ग्रंथालयाच्या बांधकामासाठी या किटचा वापर करताना, विखंडन वेळ अनुकूल करण्याची शिफारस केली जाते (विखंडन वेळ कमी करा किंवा विखंडन करत नाही).

3. उत्पादन मॅन्युअलमध्ये प्रदान केलेल्या आकार निवडीच्या पायरीचा वापर करून, घातलेल्या सेगमेंटमध्ये किंचित विचलन कशामुळे होऊ शकते?

आकार निवड या उत्पादन नियमावलीतील आकार निवडीच्या पायरीनुसार काटेकोरपणे केली जाईल. जर विचलन असेल तर, कारण असे असू शकते की चुंबकीय मणी खोलीच्या तपमानाशी संतुलित नसतात किंवा पूर्णपणे मिसळलेले नसतात, पिपेट अचूक नसतात किंवा द्रव टीपमध्ये राहतो. प्रयोगासाठी कमी शोषणासह टिपा वापरण्याची शिफारस केली जाते.

4. ग्रंथालयाच्या बांधकामात अडॅप्टर्सची निवड

लायब्ररी कन्स्ट्रक्शन किटमध्ये अॅडॉप्टर अभिकर्मक नसतो आणि TIANSeq सिंगल-इंडेक्स अॅडॉप्टर (इलुमिना) (4992641/4992642/4992378) सोबत हे किट वापरण्याची शिफारस केली जाते.

5. ग्रंथालयाचा QC

ग्रंथालयाची परिमाणात्मक शोध: क्यूबिट आणि क्यूपीसीआरचा वापर अनुक्रमे लायब्ररीची वस्तुमान एकाग्रता आणि मोलर एकाग्रता निर्धारित करण्यासाठी केला जातो. ऑपरेशन उत्पादन मॅन्युअल नुसार काटेकोरपणे आहे. ग्रंथालयाची एकाग्रता साधारणपणे एनजीएस अनुक्रमांच्या आवश्यकता पूर्ण करेल. ग्रंथालय वितरण श्रेणीचा शोध: ग्रंथालय वितरण श्रेणी शोधण्यासाठी Agilent 2100 Bioanalyzer वापरणे.

6. प्रवर्धन सायकल क्रमांकाची निवड

सूचनांनुसार, पीसीआर सायकलची संख्या 6-12 आहे, आणि आवश्यक पीसीआर सायकलची संख्या नमुना इनपुटनुसार निवडली पाहिजे. उच्च उत्पन्न असलेल्या ग्रंथालयांमध्ये, सामान्यत: प्रवर्धन विविध अंशांमध्ये होते, जे ileगिलेंट 2100 बायोएनालायझरच्या शोधात लक्ष्य श्रेणीच्या शिखराच्या नंतर थोड्या मोठ्या शिखराद्वारे प्रकट होते किंवा क्यूबिटची शोधलेली एकाग्रता qPCR पेक्षा कमी असते. सौम्य प्रवर्धन ही एक सामान्य घटना आहे, जी लायब्ररी अनुक्रम आणि त्यानंतरच्या डेटा विश्लेषणावर परिणाम करत नाही.

7. Agilent 2100 Bioanalyzer च्या शोध प्रोफाइलमध्ये स्पाइक्स दिसतात

Agilent 2100 बायोएनालायझर डिटेक्शनमध्ये स्पाइक्स दिसणे हे नमुन्यांच्या असमान तुकड्यांमुळे आहे, जेथे विशिष्ट आकारात अधिक तुकडे असतील आणि पीसीआर समृद्धीनंतर हे अधिक स्पष्ट होईल. या प्रकरणात, आकार निवड न करण्याचे सुचवले आहे, म्हणजे 15 मिनिट उष्मायनासाठी 94 ° C वर विखंडन स्थिती सेट करा, जिथे खंड वितरण लहान आणि केंद्रित आहे आणि एकजिनसीता सुधारली जाऊ शकते.