फास्टकिंग आरटी किट (gDNase सह)

ए -1 आरएनए निकृष्ट आहे

High कोणत्याही दूषिततेशिवाय उच्च दर्जाचे आरएनए शुद्ध करा. आरएनएचा ऱ्हास टाळण्यासाठी ज्या साहित्यातून आरएनए काढला जातो ते शक्य तितके ताजे असावे. आरटी प्रतिक्रियापूर्वी विकृत जेलवर आरएनए अखंडतेचे विश्लेषण करा. आरएनए काढल्यानंतर, ते 100% फॉर्ममाइडमध्ये साठवले पाहिजे. जर RNase इनहिबिटरचा वापर केला गेला, तर हीटिंग तापमान <45 ° C, आणि pH 8.0 पेक्षा कमी असावे, अन्यथा इनहिबिटर सर्व बाध्य RNase सोडेल. शिवाय, RNase इनहिबिटर solutions 0.8 mM DTT असलेल्या सोल्युशन्समध्ये जोडले जावे.

A-2 RNA मध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियांचे अवरोधक असतात

- रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन इनहिबिटरमध्ये एसडीएस, ईडीटीए, ग्लिसरॉल, सोडियम पायरोफॉस्फेट, स्पर्मिडाइन, फॉर्मामाईड, गुआनिडीन मीठ इत्यादींचा समावेश आहे. अवरोधक काढण्यासाठी 70% (v/v) इथेनॉलसह RNA पर्जन्य धुवा.

ए -3 सीडीएनएच्या पहिल्या स्ट्रँडच्या संश्लेषणासाठी वापरले जाणारे प्राइमरचे अपुरे एनीलिंग

Etनीलिंग तापमान प्रयोगात वापरल्या जाणाऱ्या प्राइमरसाठी योग्य आहे हे ठरवा. यादृच्छिक हेक्सामर्ससाठी, प्रतिक्रिया तापमानापर्यंत पोहोचण्यापूर्वी 10 मिनिटांसाठी तापमान 25 डिग्री सेल्सियसवर ठेवण्याची शिफारस केली जाते. जीन-विशिष्ट प्राइमर (जीएसपी) साठी, इतर जीएसपी वापरून पहा, किंवा ओलिगो (डीटी) किंवा यादृच्छिक हेक्सामरवर स्विच करा.

A-4 आरएनए सुरू करण्याची लहान रक्कम

- आरएनएचे प्रमाण वाढवा. 50 एनजी पेक्षा कमी आरएनए नमुन्यांसाठी, 0.1 μg ते 0.5 μg acetyl BSA पहिल्या स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषणात वापरले जाऊ शकते

A-5 लक्ष्यित क्रम विश्लेषण केलेल्या ऊतकांमध्ये व्यक्त केला जात नाही.

- इतर ऊती वापरून पहा.

A-6 PCR प्रतिक्रिया अयशस्वी

-द्वि-चरण आरटी-पीसीआरसाठी, पीसीआर चरणातील सीडीएनए टेम्पलेट प्रतिक्रिया व्हॉल्यूमच्या 1/5 पेक्षा जास्त असू शकत नाही.

A-1 प्राइमर्स आणि टेम्पलेट्सचे विशिष्ट नसलेले अॅनिलिंग

-प्राइमरच्या 3'-एंडमध्ये 2-3 डीजी किंवा डीसी नसावा. यादृच्छिक प्राइमर किंवा ऑलिगो (डीटी) ऐवजी पहिल्या स्ट्रँड संश्लेषणात जीन-विशिष्ट प्राइमर वापरा. पहिल्या काही चक्रांमध्ये जास्त एनीलिंग तापमान वापरा आणि नंतर कमी एनीलिंग तापमान वापरा. प्रतिक्रियाची विशिष्टता सुधारण्यासाठी पीसीआरसाठी हॉट-स्टार्ट ताक डीएनए पॉलिमरेझ वापरा.

A-2 जनुक-विशिष्ट प्राइमरची खराब रचना

Amp प्रवर्धन प्राइमर डिझाइनसाठी समान तत्त्वांचे अनुसरण करा.

A-3 RNA जीनोमिक DNA सह दूषित

पीसीआर-ग्रेड DNase I सह RNA चा उपचार करा. डीएनए दूषितता शोधण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनशिवाय नियंत्रण प्रतिक्रिया सेट करा.

A-4 प्राइमर डिमरची निर्मिती

3 च्या शेवटी पूरक अनुक्रमांशिवाय डिझाईन प्राइमर.

A-5 खूप जास्त Mg²⁺ एकाग्रता

- ऑप्टिमाइझ एमजी²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट आणि प्राइमर कॉम्बिनेशनसाठी एकाग्रता

A-6 विदेशी डीएनएने दूषित

-एरोसोल-प्रतिरोधक टिपा आणि UDG एंजाइम वापरा.

A-1 पहिल्या स्ट्रँड उत्पादनाची सामग्री खूप जास्त आहे

पारंपारिक पीसीआर रिअॅक्शन स्टेपमध्ये पहिल्या स्ट्रँड उत्पादनाचे प्रमाण कमी करा.

पीसीआर रि inक्शनमध्ये A-2 खूप जास्त प्राइमर रक्कम

- प्राइमर इनपुट कमी करा.

A-3 खूप सायकल

पीसीआर प्रतिक्रिया परिस्थिती अनुकूल करा आणि पीसीआर सायकल संख्या कमी करा.

ए -4 खूप कमी एनीलिंग तापमान

Non विशिष्ट विशिष्ट आरंभ आणि विस्तार टाळण्यासाठी एनीलिंग तापमान वाढवा.

A-5 डीएनएएस डीएनएएसच्या ऱ्हासामुळे निर्माण झालेल्या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तुकड्यांचे विशिष्ट-विशिष्ट प्रवर्धन-डीएनए दूषण टाळण्यासाठी उच्च-गुणवत्तेचा आरएनए काढा.

आरटी-पीसीआर म्हणजे आरएनएला सीडीएनएमध्ये उलट करणे, आणि नंतर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेड सीडीएनएचा वापर पीसीआर रिअॅक्शनसाठी टेम्पलेट म्हणून टार्गेट फ्रॅगमेंट वाढवणे. प्रयोगाच्या विशिष्ट अटींनुसार एकतर यादृच्छिक प्राइमर, ओलिगो डीटी आणि जीन विशिष्ट प्राइमर निवडा. वरील सर्व प्राइमर्स लहान युकेरियोटिक सेल mRNA साठी हेअरपिन स्ट्रक्चरशिवाय वापरता येतात.

यादृच्छिक प्राइमर: हेअरपिन स्ट्रक्चरसह लांब आरएनएसाठी योग्य, तसेच सर्व प्रकारच्या आरएनए जसे की आरआरएनए, एमआरएनए, टीआरएनए इ. ते प्रामुख्याने एकल टेम्पलेटच्या आरटी-पीसीआर रि forक्शनसाठी वापरले जातात.

Oligo dT: PolyA टेलिंगसह RNA साठी योग्य कारण ओलिगो डीटी पॉलीए शेपटीला बांधलेले आहे, आरएनए नमुन्यांची गुणवत्ता उच्च असणे आवश्यक आहे आणि अगदी थोड्या प्रमाणात क्षीणता पूर्ण-लांबीच्या सीडीएनए संश्लेषणाचे प्रमाण मोठ्या प्रमाणात कमी करेल.

जीन-विशिष्ट प्राइमर: टेम्पलेट अनुक्रमांना पूरक, जेथे लक्ष्य अनुक्रम ज्ञात आहे अशा परिस्थितीसाठी योग्य.

दोन मार्ग आहेत:

1. अंतर्गत संदर्भ पद्धत: सिद्धांतानुसार, सीडीएनए वेगवेगळ्या लांबीचे डीएनए तुकडे आहेत, त्यामुळे इलेक्ट्रोफोरेसीसचा परिणाम स्मियर आहे. जर आरएनए मुबलकता कमी असेल तर कोणतेही उत्पादन इलेक्ट्रोफोरेसीसमध्ये दिसून येणार नाही, परंतु याचा अर्थ असा नाही की पीसीआरद्वारे कोणतेही उत्पादन वाढवले ​​जाणार नाही. सर्वसाधारणपणे, अंतर्गत संदर्भ सीडीएनए शोधण्यासाठी वापरला जाऊ शकतो. जर अंतर्गत संदर्भाचे परिणाम असतील, तर सीडीएनएची गुणवत्ता मुळात हमी दिली जाऊ शकते (काही प्रकरणांमध्ये, जर लक्ष्य जनुकाचा तुकडा बराच मोठा असेल तर अपवाद असू शकतात).

2. जर या टेम्पलेटद्वारे एखादा ज्ञात जनुक वाढवला गेला असेल, तर तो या जनुकाच्या प्राइमरद्वारे सत्यापित केला जाऊ शकतो. अंतर्गत संदर्भाच्या प्रवर्धनाचा अर्थ असा नाही की सीडीएनएमध्ये कोणतीही समस्या नाही. कारण सीडीएनएमध्ये अंतर्गत संदर्भाचे प्रमाण जास्त आहे, ते वाढवणे सोपे आहे. संभाव्यतेच्या दृष्टीकोनातून, सीडीएनए विविध कारणांमुळे अंशतः निकृष्ट झाल्यास, कमी विपुलता लक्ष्यित जनुकांच्या पीसीआर परिणामांवर मोठ्या प्रमाणात परिणाम होईल. अंतर्गत संदर्भ अजूनही भरपूर प्रमाणात असताना, प्रवर्धन कदाचित प्रभावित होणार नाही.

आरएनएचा अंशतः ऱ्हास. आरएनएची अखंडता आणि शुद्धीकरण शोधा

वेगवेगळ्या प्रजातींची आरएनए सामग्री भिन्न असू शकते, परंतु सर्वसाधारणपणे, काढलेल्या एकूण आरएनएमध्ये जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसमध्ये दोन स्पष्ट 28S आणि 18S बँड असावेत आणि पूर्वीच्या बँडची चमक नंतरच्यापेक्षा दुप्पट असावी. 5S बँड सूचित करते की आरएनएची निकृष्टता झाली आहे आणि त्याची चमक कमी होण्याच्या प्रमाणात आहे. अंतर्गत संदर्भाच्या यशस्वी प्रवर्धनाचा अर्थ असा नाही की आरएनएमध्ये कोणतीही अडचण नाही, कारण अंतर्गत संदर्भ उच्च मुबलक प्रमाणात आहे, जोपर्यंत र्‍हास तीव्र होत नाही तोपर्यंत आरएनए वाढवता येते. ओडी₂₆₀/ओडी₂₈₀स्पेक्ट्रोफोटोमीटरने मोजलेल्या शुद्ध आरएनएचे गुणोत्तर 1.9 ते 2.1 दरम्यान असावे. आरएनएमध्ये प्रथिने अशुद्धतेचे थोडे प्रमाण गुणोत्तर कमी करेल. जोपर्यंत मूल्य खूप कमी नाही, तोपर्यंत आरटी प्रभावित होणार नाही. RT साठी सर्वात महत्वाची गोष्ट म्हणजे RNA अखंडता.

अंतर्गत संदर्भ जनुकाचा विस्तार केवळ आरटी यशस्वी झाल्याचे दर्शवू शकतो, परंतु ते सीडीएनए स्ट्रँडच्या गुणवत्तेशी संबंधित नाही. कारण अंतर्गत संदर्भ तुकडे साधारणपणे आकाराने लहान आणि अभिव्यक्तीमध्ये जास्त असतात, ते उलट लिप्यंतरणात यशस्वी होणे सोपे असते. तथापि, लक्ष्य जनुकाचा आकार आणि अभिव्यक्ती जनुकानुसार बदलते. सीडीएनए गुणवत्ता केवळ अंतर्गत संदर्भाद्वारे निश्चित केली जाऊ शकत नाही, विशेषत: 2 केबी पेक्षा जास्त लक्ष्यित तुकड्यांसाठी.

काही नमुन्यांमध्ये गुंतागुंतीची दुय्यम रचना असते, किंवा त्यात समृद्ध जीसी सामग्री असते, किंवा कमी विपुलतेने मौल्यवान असतात. या प्रकरणांमध्ये, लक्ष्यित तुकड्याच्या आकारानुसार आणि नमुन्यानुसार योग्य रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस निवडले पाहिजे. उच्च जीसी सामग्री आणि जटिल दुय्यम संरचना असलेल्या आरएनए टेम्पलेटसाठी, कमी तापमानात किंवा सामान्य रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेससह दुय्यम संरचना उघडणे कठीण आहे. या टेम्प्लेट्ससाठी, क्वांट रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस निवडले जाऊ शकते, कारण त्याचे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन परफॉर्मन्स एम-एमएलव्ही सीरीज रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसपेक्षा स्पष्टपणे चांगले आहे, जे विविध आरएनए टेम्प्लेट्स रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्ट करू शकते आणि आरएनएला सीडीएनए फर्स्ट स्ट्रँडमध्ये जास्तीत जास्त लिप्यंतरित करू शकते. सामान्य रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस किट वापरताना, 20 μl प्रणाली केवळ एकूण आरएनएच्या 1 μg प्रतिलिपी प्रभावीपणे रिव्हर्स करू शकते. कृपया किटच्या कमाल आरटी क्षमतेकडे लक्ष द्या. जर टेम्पलेट जास्त प्रमाणात जोडले गेले, तर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उच्च मुबलकतेसह आरएनएला अनुकूल करेल. म्हणून, सिस्टमच्या कमाल क्षमतेपेक्षा जास्त न करणे चांगले आहे.

A-1 RNA गंभीरपणे खराब झाला आहे का आणि RT यशस्वी आहे का ते ठरवा

सर्वसाधारणपणे, अंतर्गत संदर्भ प्रवर्धन अयशस्वी होण्याचे कारण अनेकदा गंभीर आरएनए ऱ्हासामुळे होते. दुसरे संभाव्य कारण म्हणजे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन अपयश. सीडीएनए सिंगल स्ट्रँडच्या गुणवत्तेचा न्याय करण्यासाठी आंतरिक संदर्भ मानक म्हणून वापरला जाऊ शकत नाही, परंतु आरएनए गुणवत्तेत कोणतीही समस्या नसल्यास रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन यशस्वी आहे की नाही याचा न्याय करण्यासाठी मानक म्हणून वापरला जाऊ शकतो. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रियेतील सर्वात महत्वाची गोष्ट म्हणजे प्रतिक्रिया कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी सतत तापमान आणि स्थिर प्रतिक्रिया प्रणाली राखणे.

A-2 आंतरिक संदर्भ जीन्स वाढवण्यासाठी प्राइमर विश्वसनीय आहेत का आणि पीसीआरमध्ये वापरल्या गेलेल्या अभिकर्मकांमध्ये काही समस्या असल्यास निर्धारित करा.

सापेक्ष प्रमाणीकरणासाठी, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनपूर्वी आरएनएचे प्रमाण निश्चित करणे आवश्यक आहे, जे अनेक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन किटमध्ये देखील आवश्यक आहे, उदाहरणार्थ, आरएनए इनपुट 1 μg म्हणून प्रमाणित करा. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेड सीडीएनए हे आरएनए, ऑलिगो डीटी, एंजाइम, डीएनटीपी आणि अगदी थोडे डीएनए अवशेषांसह मिश्रित समाधान असल्याने, विचलन होईल, म्हणून सीडीएनएचे अचूक परिमाण करणे अशक्य आहे. म्हणून, आरएनए प्रमाणन आवश्यक आहे. वेगवेगळ्या नमुन्यांमध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता समान आहे, प्राप्त सीडीएनएचे प्रमाण समान असावे आणि परिमाणात्मक विश्लेषण एकूण आरएनएच्या समान रकमेमध्ये वेगवेगळ्या जनुकांच्या अभिव्यक्ती पातळीची तुलना दर्शवू शकते. रिलेटिव्ह फ्लोरोसेंस क्वांटिटेटिव पीसीआर करताना, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन नंतर क्वांटिटेटिव्ह सीडीएनएची आवश्यकता असू शकत नाही कारण अंतर्गत रेफरन्स जीन संदर्भ म्हणून काम करू शकते.

हे प्रामुख्याने जनुकांशी संबंधित आहे, आणि लांब तुकड्यांचे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन बहुतेक जनुकांसाठी व्यवहार्य नाही. प्रथम, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनची कार्यक्षमता पीसीआरपेक्षा खूपच कमी आहे. दुसरे म्हणजे, जीसी समृद्ध प्रदेश आणि अनेक जनुकांची दुय्यम रचना रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि पीसीआर दोन्ही प्रतिबंधित करते. शेवटी, पीसीआरची निष्ठा आणि प्रवर्धन कार्यक्षमता एकाच वेळी हमी देणे कठीण आहे. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनच्या प्रक्रियेत, कमी कॉपी जनुकांसाठी, विशेषत: ऑलिगो डीटीचा वापर करून कोणीही लांब तुकडा मिळण्याची हमी देऊ शकत नाही. अधिक GC सह 5 'UTR साठी, ते आणखी कठीण आहे. म्हणूनच, यादृच्छिक प्राइमरसह प्रतिलिपी उलटा करणे, लक्ष्यित तुकड्यात नैसर्गिक क्लीवेज साइट्स शोधणे, विभागांद्वारे वाढवणे आणि नंतर निर्बंध पचन आणि बंधन करणे ही एक वाजवी पद्धत आहे. सर्वसाधारणपणे, 2 kb पेक्षा मोठे तुकडे थेट वाढवणे अवघड आहे, परंतु ते मिळवणे नेहमीच अशक्य नसते: 1. सर्व प्रथम, आरएनए/एमआरएनएच्या अखंडतेची हमी द्या आणि ट्रायझोल एक्सट्रॅक्शनला प्राधान्य दिले जाते. 2. एम-एमएलव्ही आरटी-पीसीआर किट थेट वापरली जाऊ शकते. एनीलिंग वेळ वाढवा आणि प्रवर्धन प्रक्रियेत सायकल संख्या योग्यरित्या वाढवा. वैकल्पिकरित्या, नेस्टेड पीसीआर लागू केला जाऊ शकतो किंवा सामान्य पीसीआर प्रवर्धनापूर्वी योग्यरित्या विस्तारित विकृतीकरण आणि विस्तार वेळेसह प्रथम एक किंवा दोन प्रतिक्रिया करू शकतो, ज्यामुळे तुकडे वाढवण्यास मदत होऊ शकते. पॉलिमरेझच्या निष्ठाकडे लक्ष द्या. 3. आदर्श परिणाम प्राप्त करण्यासाठी PCR मध्ये दीर्घ ताकाचा वापर केला जाऊ शकतो. 4. प्रोटीन अभिव्यक्ती अनुप्रयोगासाठी, उच्च निष्ठा पॉलिमरेझ लागू केले जावे.

TIANGEN द्वारे ऑफर केलेले दोन प्रकारचे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आहेत: Quant/King RTase आणि TIANScript M-MLV. त्यांच्यातील मुख्य फरक टेम्पलेट्सची इनपुट रक्कम आहे. क्वांट एक अद्वितीय रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आहे, जो सामान्यतः वापरल्या जाणाऱ्या M-MLV पेक्षा वेगळा आहे जो Moloney murine leukemia विषाणूपासून मिळतो. क्वांट हे एक नवीन उच्च-कार्यक्षमता रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आहे जे अभियांत्रिकी एस्चेरिचिया कोली द्वारे पुन्हा व्यक्त केले जाते. उच्च रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनल क्रियाकलाप आणि उच्च उत्पन्न असलेल्या आरएनएच्या 50 एनजी -2 μg वाढविण्यासाठी क्वांट योग्य आहे. सामान्य एमएमएलव्ही किंवा एएमव्हीच्या तुलनेत, क्वांटचे सर्वात मोठे वैशिष्ट्य म्हणजे ते आरएनए टेम्पलेट्सशी खूप मजबूत आहे आणि उच्च तापमान विकृतीशिवाय प्रतिलिपी जटिल टेम्पलेट्स उलट करू शकते. उच्च जीसी सामग्री असलेल्या टेम्पलेटसाठी, उलट कार्यक्षमता जास्त असते. तथापि, या रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये RNase H क्रियाकलाप आहे, जो सीडीएनए उत्पादनाच्या लांबीवर परिणाम करू शकतो (<4.5 kb टेम्पलेटसाठी योग्य). पारंपारिक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी, TIANScript MMLV रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसची शिफारस केली जाते. हे RTase अतिशय कमकुवत RNase H क्रियाकलाप असलेले सुधारित एंजाइम आहे, जे दीर्घ (> 5 kb) सीडीएनए संश्लेषणासाठी योग्य आहे.

सीडीएनए संश्लेषण आणि प्रवर्धन दरम्यान ट्यूब कव्हर न उघडता एक-पायरी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि पीसीआर प्रवर्धन एकाच ट्यूबमध्ये पूर्ण केले जाते, जे दूषितता कमी करण्यासाठी उपयुक्त आहे. प्राप्त केलेले सर्व सीडीएनए नमुने प्रवर्धनासाठी वापरले जात असल्याने, एकूण आरएनएच्या किमान 0.01 पीजी सह संवेदनशीलता जास्त आहे. यशस्वी एक-चरण आरटीपीसीआर साठी, सामान्यत: सीडीएनए संश्लेषण सुरू करण्यासाठी जीन-विशिष्ट प्राइमर वापरले जातात. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि पीसीआर अॅम्प्लिफिकेशन ही दोन-पायरी पद्धत दोन टप्प्यांमध्ये केली जाते. सर्वप्रथम सीडीएनए प्राप्त करण्यासाठी आरएनए टेम्पलेटमधून रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन केले जाते आणि प्राप्त सीडीएनए एक किंवा अधिक वेगवेगळ्या पीसीआर प्रतिक्रियांच्या अधीन असतात. सीडीएनएच्या पहिल्या स्ट्रँडच्या संश्लेषणास मार्गदर्शन करण्यासाठी द्वि-चरण पद्धत ऑलिगो (डीटी) किंवा यादृच्छिक प्राइमर वापरू शकते आणि एका विशिष्ट नमुन्यातून सर्व एमआरएनए माहिती पुनर्लेखन करू शकते.