2, Pfu PCR मिक्स

A-1 साचा

Template टेम्पलेटमध्ये प्रथिनेची अशुद्धता किंवा टाक इनहिबिटर वगैरे असतात. DNA डीएनए टेम्पलेट शुद्ध करा, प्रोटीनची अशुद्धता काढून टाका किंवा शुध्दीकरण किटसह टेम्पलेट डीएनए काढा.

Template टेम्पलेटचे विकृतीकरण पूर्ण झाले नाही den योग्यरित्या विकृतीकरण तापमान वाढवा आणि विकृतीकरण वेळ वाढवा.

■ टेम्पलेट डिग्रेडेशन the टेम्पलेट पुन्हा तयार करा.

ए -2 प्राइमर

Pri प्राइमरची खराब गुणवत्ता-प्राइमर पुन्हा संश्लेषित करा.

■ प्राइमर डिग्रेडेशन —— उच्च एकाग्रतेच्या प्राइमर्सला संरक्षणासाठी लहान प्रमाणात विभाजित करा. एकाधिक गोठवणे आणि पिघलना किंवा दीर्घकालीन 4 ° C क्रायोप्रेस्ड टाळा.

Pri प्राइमर्सची अयोग्य रचना (उदा. प्राइमरची लांबी पुरेशी नाही, प्राइमरच्या दरम्यान डायमर तयार होतो इ.)

A-3 Mg²⁺एकाग्रता

■ एमजी²⁺ एकाग्रता खूप कमी आहे - Mg मध्ये योग्य वाढ करा²⁺ एकाग्रता: एमजी ऑप्टिमाइझ करा²⁺ इष्टतम एमजी निर्धारित करण्यासाठी 0.5 मिमीच्या अंतराने 1 एमएम ते 3 एमएम पर्यंत प्रतिक्रियांच्या मालिकेद्वारे एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट आणि प्राइमरसाठी एकाग्रता.

ए -4 एनीलिंग तापमान

An उच्च एनीलिंग तापमान प्राइमर आणि टेम्पलेटच्या बंधनावर परिणाम करते. Neनीलिंग तापमान कमी करा आणि 2 ° C च्या ग्रेडियंटसह स्थिती अनुकूल करा.

A-5 विस्तार वेळ

■ लहान विस्तार वेळ extension विस्तार वेळ वाढवा.

घटना: samplesणात्मक नमुने देखील लक्ष्य अनुक्रम बँड दर्शवतात.

पीसीआरचे ए -1 संदूषण

Target लक्ष्य अनुक्रम किंवा प्रवर्धन उत्पादनांचे क्रॉस दूषण - sampleणात्मक नमुन्यात लक्ष्य अनुक्रम असलेले नमुना पाईपेट करू नये किंवा त्यांना सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमधून बाहेर टाकू नये. विद्यमान न्यूक्लिक acसिड नष्ट करण्यासाठी अभिकर्मक किंवा उपकरणे स्वयंचलित केली पाहिजेत आणि नकारात्मक नियंत्रणाच्या प्रयोगांद्वारे दूषित होण्याचे अस्तित्व निश्चित केले पाहिजे.

■ अभिकर्मक दूषित the अभिकर्मक आणि कमी तापमानावर साठवा.

ए -2 प्राइमr

■ एमजी²⁺ एकाग्रता खूप कमी आहे - Mg मध्ये योग्य वाढ करा²⁺ एकाग्रता: एमजी ऑप्टिमाइझ करा²⁺ इष्टतम एमजी निर्धारित करण्यासाठी 0.5 मिमीच्या अंतराने 1 एमएम ते 3 एमएम पर्यंत प्रतिक्रियांच्या मालिकेद्वारे एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट आणि प्राइमरसाठी एकाग्रता.

■ अयोग्य प्राइमर डिझाइन, आणि लक्ष्य अनुक्रमामध्ये लक्ष्य नसलेल्या अनुक्रमासह एकरूपता आहे. -प्राइमर पुन्हा डिझाइन करा.

घटना: पीसीआर प्रवर्धन बँड अपेक्षित आकाराशी विसंगत असतात, एकतर मोठे किंवा लहान, किंवा कधीकधी दोन्ही विशिष्ट प्रवर्धन बँड आणि विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन बँड होतात.

ए -1 प्राइमर

Pri खराब प्राइमर विशिष्टता

-प्राइमर पुन्हा डिझाइन करा.

■ प्राइमर एकाग्रता खूप जास्त आहे - योग्यरित्या विकृतीकरण तापमान वाढवा आणि विकृतीकरण वेळ वाढवा.

A-2 Mg²⁺ एकाग्रता

Mg एमजी²⁺ एकाग्रता खूप जास्त आहे - Mg2+ एकाग्रता योग्यरित्या कमी करा: Mg ऑप्टिमाइझ करा²⁺ इष्टतम एमजी निर्धारित करण्यासाठी 0.5 मिमीच्या अंतराने 1 एमएम ते 3 एमएम पर्यंत प्रतिक्रियांच्या मालिकेद्वारे एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट आणि प्राइमरसाठी एकाग्रता.

ए -3 थर्मोस्टेबल पॉलिमरेज

En जास्त सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य प्रमाण en 0.5 U च्या अंतराने सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य प्रमाण योग्यरित्या कमी करा.

ए -4 एनीलिंग तापमान

Ne neनीलिंग तापमान खूप कमी आहे rop neनीलिंग तापमान योग्यरित्या वाढवा किंवा दोन-स्टेज अॅनीलिंग पद्धत स्वीकारा

A-5 PCR सायकल

PC खूप जास्त पीसीआर सायकल - पीसीआर सायकलची संख्या कमी करा.

ए -1 प्राइमरOor खराब विशिष्टता-प्राइमरची पुन्हा रचना करा, प्राइमरची स्थिती आणि लांबी बदलून त्याची विशिष्टता वाढवा; किंवा नेस्टेड पीसीआर करा.

A-2 साचा DNA

- टेम्पलेट शुद्ध नाही - टेम्पलेट शुद्ध करा किंवा शुध्दीकरण किटसह डीएनए काढा.

A-3 Mg²⁺ एकाग्रता

—— एमजी²⁺ एकाग्रता खूप जास्त आहे - एमजी योग्यरित्या कमी करा²⁺ एकाग्रता: एमजी ऑप्टिमाइझ करा²⁺ इष्टतम एमजी निर्धारित करण्यासाठी 0.5 मिमीच्या अंतराने 1 एमएम ते 3 एमएम पर्यंत प्रतिक्रियांच्या मालिकेद्वारे एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट आणि प्राइमरसाठी एकाग्रता.

A-4 dNTP

- डीएनटीपीची एकाग्रता खूप जास्त आहे - डीएनटीपीची एकाग्रता योग्यरित्या कमी करा

ए -5 एनीलिंग तापमान

Low खूप कमी neनीलिंग तापमान - neनीलिंग तापमान योग्यरित्या वाढवा

A-6 सायकल

- बरीच सायकल - सायकल संख्या ऑप्टिमाइझ करा

पहिली पायरी म्हणजे योग्य पॉलिमरेज निवडणे. 3'-5 'एक्झोन्यूक्लीझ अॅक्टिव्हिटीच्या अभावामुळे नियमित टाक पॉलिमरेझ प्रूफरीड करू शकत नाही आणि न जुळल्याने तुकड्यांची विस्तार कार्यक्षमता मोठ्या प्रमाणात कमी होईल. म्हणून, नियमित ताक पॉलिमरेझ 5 केबी पेक्षा मोठ्या लक्ष्यित तुकड्यांना प्रभावीपणे वाढवू शकत नाही. विस्तार कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी आणि दीर्घ खंड प्रवर्धनाच्या गरजा पूर्ण करण्यासाठी विशेष सुधारणा किंवा इतर उच्च निष्ठा असलेल्या पॉलिमरेझसह ताक पॉलिमरेज निवडले पाहिजे. याव्यतिरिक्त, लांब तुकड्यांच्या प्रवर्धनासाठी देखील प्राइमर डिझाइन, डिनाटुरेशन वेळ, विस्तार वेळ, बफर पीएच इत्यादींचे समायोजन आवश्यक आहे, सहसा, 18-24 बीपी सह प्राइमर चांगले उत्पादन देऊ शकतात. टेम्पलेटचे नुकसान टाळण्यासाठी, 94 ° C वर विकृतीकरण वेळ प्रति सेकंद 30 सेकंद किंवा त्यापेक्षा कमी असावा आणि प्रवर्धन करण्यापूर्वी तापमान 94 ° C पर्यंत वाढवण्याची वेळ 1 मिनिटापेक्षा कमी असावी. शिवाय, विस्तार तपमान सुमारे 68 ° C वर सेट करणे आणि 1 kb/min च्या दरानुसार विस्तार वेळेची रचना करणे लांब तुकड्यांचे प्रभावी प्रवर्धन सुनिश्चित करू शकते.

उच्च निष्ठा असलेल्या विविध डीएनए पॉलिमेरेसचा वापर करून पीसीआर प्रवर्धनाचा त्रुटी दर कमी केला जाऊ शकतो. आतापर्यंत सापडलेल्या सर्व ताक डीएनए पॉलिमेरेसमध्ये, पीएफयू एंजाइममध्ये सर्वात कमी त्रुटी दर आणि सर्वोच्च निष्ठा आहे (संलग्न तक्ता पहा). सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य निवड व्यतिरिक्त, संशोधक प्रतिक्रिया परिस्थिती अनुकूल करून पीसीआर उत्परिवर्तन दर कमी करू शकतात, ज्यात बफर रचना, थर्मोस्टेबल पॉलिमरेझची एकाग्रता आणि पीसीआर सायकल क्रमांक ऑप्टिमाइझ करणे समाविष्ट आहे.